Где происходит синтез атф. Энергетика. Синтез АТФ в митохондриях. Молекулярные механизмы процессов энергетического сопряжения Синтез атф осуществляется в

Для нас сейчас важно, зато молекула аденозинтрифосфорной кислоты содержит так называемую макроэргическую связь. Реакция синтеза представлена на схеме.

АДФ+Ф ==> АТФ +H 2 O

Из аденозиндифосфата и фосфата получается АТФ, при этом образуется так называемая макроэргическая связь, и на ее образование затрачивается 30,6 кДж/моль (7,3 ккал/моль). АТФ обеспечивает энергией большинство происходящих в клетке процессов, так как при гидролизе макроэргической связи запасенная в ней энергия освобождается.

Как же синтезируется эта молекула, то есть, как образуется макроэргическая связь между фосфатами? Это было одно время загадкой. Существовало предположение о том, что есть какое-то вещество Х, химический посредник, осуществляет связь между процессами, дающими энергию, то есть окислением питательных веществ до СО2 и Н2О, и каким -то образом энергия окисления (в своем роде медленное "горение" внутри организма) переходит в энергию макроэргической связи в молекуле АТФ. Это предположение о наличии химического посредника, которого никто найти не мог, называлось гипотезой химического сопряжения (рис. 6).

Но в 1961 г. английский ученый Питер Митчелл предложил другое объяснение - хемиосмотическую гипотезу (подробнее мы о ней будем говорить позже), которая заключается в том, что вода, которая образуется в процессе окисления, образуется не в виде молекулы воды, а виде протона H+ и иона гидроксила OH - . Энергия, получаемая при окислении, идет на то, чтобы продукты реакции - протон и гидроксил - разделить в пространстве. Протон выбрасывается из митохондрий через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство (сам по себе протон не может проникнуть через мембрану митохондрии, эта мембрана непроницаема для заряженных частиц), и гидроксогруппы, которая остается внутри митохондрии.

В результате возникает разница концентраций ионов водорода (∆рН - то есть кислотности среды) и разница потенциала: положительные заряды снаружи митохондриальной мембраны, а отрицательный внутри. Напомним, что у митохондрий 2 мембраны, причем внешняя в энергетических процессах такой важной роли, как внутренняя, не играет. То есть энергия, полученная при окислении, запасена в виде электрохимической энергии. Электрический потенциал на мембране митохондрий достигает 200 милливольт, а толщина мембраны не превышает 10 нм.

Питер Митчелл первый высказал предположение о том, что химические реакции в клетке пространственно упорядочены, и продукты реакции распределяются асимметрично: протон в одну сторону, гидроксил в другую. За счет этого появляется электрохимический потенциал на мембране (обозначается Δμн). Он состоит из химической (∆рН - разница в концентрации протонов) и электрической (Δφ - разница в величине заряда) компоненты Δμн=∆рН + Δφ. Электрохимический потенциал на мембране митохондрий - универсальная форма запасания энергии клеткой.

Протоны могут перекачиваться через мембрану и при фотосинтезе в хлоропластах или в клетках фотосинтезирующих бактерий (Рис. 8).

На рисунке представлена довольно простая система бактериального фотосинтеза, сопряженного с синтезом АТФ на примере галобактерий. Галобактерии живут в Мертвом море. Море настолько соленое, что соль выпадает в осадок, но в таких экстремальных условиях галобактерии прекрасно себя чувствуют. Галобактерии используют фотосинтез для получения энергии. Белок бактериородопсин под действием света выкачивает протоны изнутри бактериальной клетки наружу, и на мембране снаружи избыток протонов, и, соответственно, образуется положительный заряд. То есть в данном случае электрохимический потенциал на мембране бактерии возникает не за счет окисления веществ в процессе дыхания, а за счет работы, связанной со световой энергией.

Если протон "падает" сквозь мембрану внутрь митохондрии, при этом его потенциальная энергия уменьшается, так как он "падает" в электрическом поле от положительного заряда к отрицательному, и вдобавок по градиенту концентрации. Эта энергия используется для синтеза АТФ. И далее пойдет речь о том, как это происходит.

Синтезом АТФ занимается молекулярная машина, которая называется АТФ-синтаза. Она состоит из двух частей. Первая погружена в мембрану называется F 0 (см. рисунок). Она представляет собой протонный канал, то есть это дыра в мембране, по которой протон может попасть внутрь митохондрии, но попадает он внутрь с потерей энергии, которую улавливает вторая часть молекулярной машины, которая называется F 1 . Эта часть АТФ-синтазы торчит внутрь митохондрии и использует энергию "падающих" через F 0 протонов для того, чтобы аденозиндифосфат соединился с фосфатом посредством макроэргической связи и образовал молекулу АТФ.

Рассмотрим, как АТФ-синтаза синтезирует АТФ. Оказывается, что прежде всего совершается работа механическая, так как для осуществления синтеза АТФ в АТФ-синтазе крутится белковая структура. Как устроена АТФ-синтаза?

Она состоит из двух частей - статора (на рисунке 9 помечено синим цветом), и ротора (обозначен красным). Статор состоит из трех альфа субъединиц и трех бета субъединиц - они занимаются химической частью работы: синтезом АТФ из АДФ и фосфата. В собранном состоянии все вместе эти субъединицы по форме напоминают слега приплюснутый шар 8 нм в высоту и 10 нм в диаметре.

К ним примыкает дельта субъединица, и все вместе эта система образует F1 субъединицу молекулярной машины. Здесь же есть опора, которая «якорит» всю систему в мембране. Как известно, мембрана сделана из фосфолипидов (на рисунке показаны желтым). Гидрофильные "головки" фосфолипидов обращены в водную поверхность, а гидрофобные "хвосты" погружены внутрь мембраны, и именно они препятствуют перемещению заряженных частиц через мембрану. Вращающаяся часть машины, ротор, состоит из гамма и эпсилон субъединиц. Эта конструкция погружена в структуру, сделанную из одинаковых белков, они обозначаются буквой с. Статор держится в мембране, а ротор крутится. И энергия протона используется на то, чтобы прокрутить ротор этой машины.

Молекулярная машина работает в обе стороны (так же как и катализаторы, которые проводят реакцию как в прямую, так и в обратную стороны). Если течет протонный ток с наружной мембраны внутрь, то синтезируется АТФ; если же протонного потенциала нет, но подать с внутренней стороны АТФ, то машина начнет «выкачивать» протоны, создавая протонный потенциал. При этом ротор также вращается.

Для того, чтобы доказать, что в АТФ синтазе вращается часть машины, F1 фрагмент перевернули, «пришили» к неподвижной подложке, а к гамма-субъединице навесили искусственным образом нить актина (длинный белок, который можно было увидеть в микроскоп, так как он был мечен флуоресцентной меткой). Затем подали к этой системе энергию в виде АТФ, и оказалось, что при наличии АТФ гамма субъединица начала крутиться. Все это сняли на пленку. Было видно, как крутится флуоресцентная метка на актиновом хвостике, и было показано, что действительно происходит вращение во время работы этой молекулярной машины (рис. 10).

Теперь разберем, как же крутится этот ротор; как работает электромотор в мембране клеток, как у бактерий, так и у митохондрий высших организмов. Если вы вспомните временную ось возникновения жизни, то увидите, что возникнуть этот мотор должен был более трех миллиардов лет назад.

Как же используется протонный ток, чтобы крутить мотор? Оказалось, что в статоре имеется протонный канал, т.е. такой белок, который образует проход для протона. Но этот канал не сплошной. Если бы был канал, который пронизывал всю мембрану насквозь, то из-за разницы потенциалов все протоны потекли бы внутрь митохондрии, и произошла бы деэнергетизация мембраны, т.е. она бы разрядилась. Но канал устроен очень хитро. Он состоит из двух половинок (полу-каналов), которые, к тому же, смещены одна относительно другой (рис. 1).

Структура этой машины такова, что протон проваливается через полуканал с наружной стороны митохондриальной мембраны, но попасть внутрь митохондрии он не может. Сваливается протон на подставленную ему аминокислоту ротора и эту аминокислоту протонирует, то есть на аминокислоте появляется дополнительный положительный заряд. Затем, когда протонированная аминокислота на вращающемся роторе доедет до следующей половинки канала, ведущей уже внутрь митохондрии (а внутри протонов мало и, кроме того, там протон поджидают отрицательно заряженные ионы), то протон наконец "падает" внутрь и аминокислота освобождается от положительного заряда. Заряды в роторе и статоре расположены таким образом, что протонирование - депротонирование приводит к повороту машины. Таким образом, протон в два приема проваливается внутрь митохондрии, и за счет этого мотор проворачивается.

За объяснение ферментативного механизма, лежащего в основе синтеза АТФ, два исследователя получили Нобелевскую премию: Пол Д. Бойер, США и Джон Э. Уолкер, Великобритания (Нобелевская премия 1997 года).

Было рассказано, как мотор крутится, но не было объяснено, почему синтезируется АТФ. Сейчас подробно мы на этом останавливаться не будем, но вкратце, объяснить это можно следующим образом. Представим АТФ в таком виде: АТФ=АДФ~Ф. Собственно, почему при разрыве этой связи выделяется большое количество энергии? При разрыве образуется отрицательно заряженный фосфат, который гидратируется (покрывается «шубой» из молекул воды). Как вы помните, вода - это диполь (кислород имеет частично отрицательный заряд, а два водорода - положительный). И за счет гидратирования эта энергия и получается. Но если синтез АТФ идет в той среде, где воды нет, т.е. в гидрофобной среде, то макроэргической эта реакция не является. Показано, что когда происходит образование ковалентной связи между фосфатными группами молекул АДФ и Ф, ферменту практически не требуется энергии. Реакции синтеза и гидролиза ATP в каталитическом центре фермента активно идут при отсутствии внешнего источника энергии. Условия, в которых находятся молекулы АДФ и Ф в каталитическом центре, существенно отличаются от условий протекания реакции в водной среде, благодаря чему образование молекулы АТФ в активном центре фермента может происходить энергетически "бесплатно". Энергия "падающих" протонов тратится потом на то, чтобы «выпихнуть» вон АТФ, отцепить его от каталитической субъединицы.

Таким образом, за счет электрохимического потенциала на внутренней мембране митохондрий внутри клетки или митохондрий совершается механическая работа, сопряженная с химическим синтезом.

На рисунке виден срез митохондрии (рис. 12). Внутри содержится матрикс и выросты (складки) - кристы, на которых и расположена АТФ-синтаза. Зачем нужны складки? Чтобы увеличить площадь поверхности. Количество складок внутри митохондрий зависит от того, насколько интенсивно ей приходится работать, сколько энергии нужно клетке. Митохондрии в клетках печени имеют гораздо меньше крист, чем, например, в клетках сердца.

В хлоропластах происходит точно такой же процесс синтеза АТФ, также работает АТФ-синтаза, как и в митохондриях, но источником протонного потенциала является уловленная энергия света. Там тоже есть складки, они называются тилакоидами. Только в хлоропластах все как бы вывернуто наизнанку. То есть протоны за счет энергии света накапливаются снаружи этих образований.

Атомы водорода, снятые с субстратов в цикле Кребса, в результате β -окисления ВЖК, а также пируватдегидрогеназной, глутаматдегидрогеназной и некоторых других реакций, поступают в дыхательную цепь ферментов (рис. 23), которая иначе называетсяэлектронотранспортной цепью .

Процесс переноса протонов и электронов (атом водорода = протон водорода (Н +) + электрон (e)) начинается с передачи атомов водорода с восстановленной формы НАД или ФАД.

Рис. 23. Схема электронотранспортной цепи

Восстановленный НАД отдает водороды на флавопротеин, ко-ферментом которого является ФМН, а восстановленный ФАД всегда передает водороды на кофермент Q. После кофермента Q по системе цитохромов осуществляется транспорт только электронов; роль конечного - терминального - акцептора электронов выполняет кислород. Перед тем как подробнее изучить работу электронотранспортной цепи, познакомимся с химическим строением отдельных ее компонентов.

Как отмечалось ранее, все компоненты электронотранспортной цепи являются ферментами, катализирующими окислительно-восстановительные процессы.

Флавопротеин является первым ферментом, акцептирующим протоны и электроны от первичной дегидрогеназы - фермента, снимающего атомы водорода непосредственно с субстрата. Кофер-ментом флавопротеина является ФМН. Со структурой и окислительно-восстановительными реакциями ФМН мы познакомились ранее (см. главу 4). Этот фермент тесно связан с железосерными белками.

Железосерные белки имеют небольшую молекулярную массу (порядка 10 кДа). Они содержат негеминовое железо, связанное с атомами серы остатков цистеина. На рис. 24 представлен лишь один из возможных вариантов комплекса атома железа с атомами серы, существующих в белках, содержащих негеминовое железо.

Рис. 24. Схема образования комплекса атома железа с атомами серы в железосерных белках

Эти белки участвуют в переносе протонов и электронов и, как предполагают, на нескольких стадиях. Однако до сих пор не ясен механизм, по которому железосерные белки претерпевают обратимое окисление-восстановление.

Кофермент Q или убихинон растворен в липидной части внутренней мембраны митохондрий. Убихинон может диффундировать как поперек, так и вдоль мембраны. Он является единственным, не связанным с белками компонентом цепи дыхания; по этой причине его нельзя отнести к ферментам. Кофермент Q принимает два протона водорода и два электрона от железосерных белков, превращаясь в гидрохинон:

Цитохромы представляют собой гемопротеины. В настоящее время известно около 30 различных цитохромов. Все они, в зависимости от своей способности поглощать свет, разделяются на классы, обозначаемые строчными буквами - а, b, с и т.д. Внутри каждого класса выделяют отдельные виды цитохромов, обозначая их цифровыми индексами - b , b 1 , b 2 и т.д.

Цитохромы отличаются друг от друга структурой тема, структурой полипептидной цепи и способом прикрепления тема к ней. На рисунке 25 показана структура тема, входящего в состав всех цитохромов b.

Цитохромы окрашены в красно-коричневый цвет; окраска обусловлена наличием катиона металла. Цитохромы классов b и с содержат в своем составе катионы железа, а цитохромы класса а - катионы меди.

Цитохромы а и a 3 образуют комплекс, который называют цито-хромоксидазой. Уникальная особенность комплекса а·а 3 заключается в том, что эта система цитохромов передает электроны непосредственно на кислород.

Перенос электронов по цепи цитохромов включает обратимые реакции:

Fe 3+ + e ----→ ←---- Fe 2+ и Сu 2+ + e ----→ ←---- Сu +

Познакомившись с характеристикой компонентов электронотранспортной цепи и с окислительно-восстановительными реакциями, протекающими в ней, перейдем к рассмотрению процесса, который является основным при аккумуляции энергии в форме АТФ.

Рис. 25. Структура тема цитохрома b

Механизм сопряжения дыхания с фосфорилированием АДФ. Транспорт протонов и электронов от восстановленного НАД к молекулярному кислороду представляет собой экзергонический процесс:

НАДН + Н + + ½О 2 → НАД + + Н 2 О + энергия

Если еще упростить запись этого процесса, то получим уравнение реакции горения водорода в кислороде, которое известно всем со школьной скамьи:

Н 2 + ½О 2 → Н 2 О + энергия

Разница состоит лишь в том, что при реакции горения энергия освобождается сразу полностью, а в цепи дыхания, благодаря тому что она разбита на несколько окислительно-восстановительных реакций, происходит поэтапное освобождение энергии. Эта энергия аккумулируется в фосфатных связях АТФ и используется для жизнедеятельности клеток.

Первым результатом работы электронотранспортной цепи является образование эндогенной воды, в молекуле которой атомы водорода являются водородами, снятыми с субстратов соответствующими дегидрогеназами, а атом кислорода - терминальным акцептором электронов (см. рис. 23). Приняв на себя 2 электрона, он превращается в реакционноспособный анион (О 2-), который сразу же взаимодействует с протонами водорода, "выброшенными" коферментом Q. Образование эндогенной воды происходит в матриксе митохондрий.

Механизм сопряжения дыхания с фосфорилированием АДФ был разработан английским биохимиком П. Митчеллом, гипотеза которого получила название протондвижущей или хемиосмотической. В нашей стране гипотеза П. Митчелла была развита в работах В.П. Скулачева.

Согласно хемиосмотической гипотезе энергия переноса протонов и электронов вдоль дыхательной цепи первоначально сосредоточивается в виде протонного потенциала, создающегося движением через мембрану заряженных протонов водорода. Транспорт протонов обратно через мембрану сопряжен с фосфорилированием АДФ, которое осуществляется протонзависимой АТФсинтазой (Н + = АТФаза).

Поскольку движущей силой синтеза АТФ является протонный потенциал, подробнее рассмотрим его образование.

Наряду с переносом протонов и электронов по цепи дыхания осуществляется дополнительный выброс протонов водорода из матрикса в межмембранное пространство. Протоны водорода возникают при диссоциации воды в матриксе:

Н 2 O -→ ←- H + + OH -

Перенос протонов водорода через внутреннюю мембрану митохондрий, как предполагают, осуществляется протонными транслоказами. В результате такого переноса мембрана со стороны матрикса заряжается отрицательно (за счет оставшихся отрицательно заряженных гидроксилов), а со стороны межмембранного пространства - положительно (за счет перекачки положительно заряженных протонов водорода). В результате такого распределения зарядов возникает электрический потенциал, обозначаемый Δψ (дельта пси). А за счет возникшей разницы в концентрации протонов водорода по обе стороны внутренней мембраны митохондрий создается химический градиент протонов, обозначаемый АрН. Оба возникших потенциала создают на мембране электрохимический трансмембранный градиент протонов (ΔμН +), следовательно ΔμН + = Δψ + ΔрН

Синтез АТФ. Мембрана, на которой создается электрохимический трансмембранный градиент протонов называетсяэнергизированной . Энергизированная мембрана стремится разрядиться за счет перекачки протонов из межмембранного пространства обратно в матрикс (рис. 26). Этот процесс осуществляется с помощью про-тонзависимой АТФазы.

Рис. 26. Синтез АТФ, сопряженный с электронотранспортной цепью

Н + -АТФаза встроена во внутреннюю мембрану митохондрий. Она похожа на гриб и состоит из двух белковых факторов F 0 и F 1 (рис. 27). Фактор F 0 пронизывает всю толщу внутренней мембраны митохондрий. Шаровидная часть, выступающая в матрикс митохондрий, - это фактор F 1 . Строение, свойства и функции этих белковых факторов совершенно разные.

Фактор F 0 состоит из трех гидрофобных полипептидных цепей разной структуры. Этот фактор выполняет функцию протонпроводящего канала, по которому протоны водорода попадают к фактору F 1 .

Фактор F 1 является водорастворимой частью Н + -АТФазы и представляет собой белковый комплекс, состоящий из девяти субъединиц пяти разных типов. Одна эпимолекула фактора F 1 содержит 3 α , 3β и по одной субъединице γ , δ , ε (α 3 β 3 γδε ). Фактор F 1 осуществляет синтез АТФ из АДФ и фосфорной кислоты. Центры связывания АДФ и АТФ находятся в субъединицах α и β каждая из которых может удерживать по одной молекуле АДФ или АТФ. Согласно данным рентгеноструктурного анализа центры связывания АДФ и АТФ находятся на стыке субъединиц α и β . Субъединица β выполняет каталитическую функцию в синтезе АТФ (рис. 27).

Рис. 27. Строение протонзависимой АТФазы

Существует несколько концепций, объясняющих механизм образования АТФ при посредстве Н + -АТФазы. Все концепции рассматривают протоны водорода, поступающие по протонпрово-дящему каналу к фактору F 1 , в качестве активаторов различных процессов, приводящих к образованию АТФ из АДФ и фосфорной кислоты.

АТФ-синтаза (Н + -АТФ-аза) - интегральный белок внутренней мембраны митохондрий. Он расположен в непосредственной близости к дыхательной цепи. АТФ-синтаза состоит из 2 белковых комплексов, обозначаемых как F 0 и F 1 (рис. 6-15).

Рис. 6-15. Строение и механизм действия АТФ-синтазы. А - F 0 и F 1 - комплексы АТФ-синтазы, В состав F 0 входят полипептидные цепи, которые образуют канал, пронизывающий мембрану насквозь. По этому каналу протоны возвращаются в матрикс из межмембранного пространства; белок F 1 выступает в матрикс с внутренней стороны мембраны и содержит 9 субъединиц, 6 из которых образуют 3 пары α и β ("головка"), прикрывающие стержневую часть, которая состоит из 3 субъединиц γ, δ и ε. γ и ε подвижны и образуют стержень, вращающийся внутри неподвижной головки и связанный с комплексом F0. В активных центрах, образованных парами субъединиц α и β, происходит связывание АДФ, неорганического фосфата (Р i) и АТФ. Б - Каталитический цикл синтеза АТФ включает 3 фазы, каждая из которых проходит поочерёдно в 3 активных центрах: 1 - связывание АДФ и Н 3 РО 4 ; 2 - образование фосфоангидридной связи АТФ; 3 - освобождение конечного продукта. При каждом переносе протонов через канал F 0 в матрикс все 3 активных центра катализируют очередную фазу цикла. Энергия электрохимического потенциала расходуется на поворот стержня, в результате которого циклически изменяется конформация α- и β-субъединиц и происходит синтез АТФ.

3.Коэффициент окислительного
фосфорилирования

Окисление молекулы NADH в ЦПЭ сопровождается образованием 3 молекул АТФ; электроны от FAD-зависимых дегидрогеназ поступают в ЦПЭ на KoQ, минуя первый пункт сопряжения. Поэтому образуются только 2 молекулы АТФ. Отношение количества фосфорной кислоты (Р), использованной на фосфорилирование АДФ, к атому кислорода (О), поглощённого в процессе дыхания, называют коэффициентом окислительного фосфорилирования и обозначают Р/О. Следовательно, для NADH Р/О = 3, для сукцината Р/О - 2. Эти величины отражают теоретический максимум синтеза АТФ, фактически эта величина меньше.

Регуляция цепи переноса электронов (дыхательный контроль). Разобщение тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования. Терморегуляторная функция тканевого дыхания. Термогенная функция энергетического обмена в бурой жировой ткани.

Дыхательный контроль

Окисление субстратов и фосфорилирование АДФ в митохондриях прочно сопряжены. Скорость использования АТФ регулирует скорость потока электронов в ЦПЭ. Если АТФ не используется и его концентрация в клетках возрастает, то прекращается и поток электронов к кислороду. С другой стороны, расход АТФ и превращение его в АДФ увеличивает окисление субстратов и поглощение кислорода. Зависимость интенсивности дыхания митохондрий от концентрации АДФ называют дыхательным контролем. Механизм дыхательного контроля характеризуется высокой точностью и имеет важное значение, так как в результате его действия скорость синтеза АТФ соответствует потребностям клетки в энергии. Запасов АТФ в клетке не существует. Относительные концентрации АТФ/АДФ в тканях изменяются в узких пределах, в то время как потребление энергии клеткой, т.е. частота оборотов цикла АТФ и АДФ, может меняться в десятки раз.

Любой организм может существовать до тех пор, пока происходит поступление питательных веществ из внешней среды и пока продукты его жизнедеятельности выделяются в эту среду. Внутри клетки происходит непрерывный очень сложный комплекс химических превращений, благодаря которым из питательных веществ образуются компоненты тела клетки. Совокупность процессов превращения материи в живом организме, сопровождающихся постоянным ее обновлением, и называется обменом веществ.

Часть общего обмена, которая состоит в поглощении, усвоении питательных веществ и создании за их счет структурных компонентов клетки, называется ассимиляцией - это конструктивный обмен. Вторую часть общего обмена составляют процессы диссимиляции, т.е. процессы разложения и окисления органических веществ, в результате которых клетка получает энергию, - это энергетический обмен. Конструктивный и энергетический обмен составляют единое целое.

В процессе конструктивного обмена клетка из довольно ограниченного числа низкомолекулярных соединений синтезирует биополимеры своего тела. Биосинтетические реакции протекают при участии разнообразных ферментов и требуют затрат энергии.

Живые организмы могут использовать только химически связанную энергию. Каждое вещество обладает определенным запасом потенциальной энергии. Главными материальными носителями ее являются химические связи, разрыв или преобразование которых приводит к освобождению энергии. Энергетический уровень одних связей имеет величину 8-10 кДж - эти связи называются нормальными. В других связях заключена значительно большая энергия - 25-40 кДж - это так называемые макроэргические связи. Почти все известные соединения, обладающие такими связями, имеют в своем составе атомы фосфора или серы, по месту которых в молекуле и локализованы эти связи. Одним из соединений, играющих важнейшую роль в жизнедеятельности клетки, является аденозинтрифосфорная кислота (АТФ).

Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ) состоит из органического основания аденина (I), углевода рибозы (II) и трех остатков фосфорной кислоты (III). Соединение аденина и рибозы называется аденозином. Пирофосфатные группы имеют макроэргические связи, обозначенные значком ~. Разложение одной молекулы АТФ с участием воды сопровождается отщеплением одной молекулы фосфорной кислоты и выделением свободной энергии, которая равна 33-42 кДж/моль. Все реакции с участием АТФ регулируются ферментными системами.

Рис.1. Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ)

Энергетический обмен в клетке. Синтез АТФ

Синтез АТФ происходит в мембранах митохондрий в процессе дыхания, поэтому все ферменты и кофакторы дыхательной цепи, все ферменты окислительного фосфорилирования локализованы в данных органеллах.

Синтез АТФ происходит таким образом, что два иона Н + отщепляются от АДФ и фосфата (Р) с правой стороны мембраны, компенсируя потерю двух Н + при восстановлении вещества В. Один из кислородных атомов фосфата переносится на другую сторону мембраны и, присоединив два иона Н + из левого отсека, образует Н 2 О. Остаток фосфорила присоединяется к АДФ, образуя АТФ.

Рис.2. Схема окисления и синтеза АТФ в митохондриальных мембранах

В клетках организмов изучено много биосинтетических реакций, использующих энергию, заключенную в АТФ, в ходе которых происходят процессы карбоксилирования и декарбоксилирования, синтеза амидных связей, образования макроэргических соединений, способных переносить энергию от АТФ к анаболическим реакциям синтеза веществ. Эти реакции играют важную роль в процессах обмена веществ растительных организмов.

С участием АТФ и других макроэргических нуклеозидполифосфатов (ГТФ, ЦТФ, УГФ) может происходить активирование молекул моносахаридов, аминокислот, азотистых оснований, ацилглицеринов путем синтеза активных промежуточных соединений, являющихся производными нуклеотидов. Так, например, в процессе синтеза крахмала с участием фермента АДФ-глюкозо-пирофосфорилазы образуется активированная форма глюкозы - аденозиндифосфатглюкоза, которая легко становится донором глюкозных остатков при формировании структуры молекул этого полисахарида.

Синтез АТФ происходит в клетках всех организмов в процессе фосфорилирования, т.е. присоединения неорганического фосфата к АДФ. Энергия для фосфорилирования АДФ образуется в ходе энергетического обмена. Энергетический обмен, или диссимиляция, представляет собой совокупность реакций расщепления органических веществ, сопровождающихся выделением энергии. В зависимости от среды обитания диссимиляция может протекать в два или три этапа.

У большинства живых организмов - аэробов, живущих в кислородной среде, - в ходе диссимиляции осуществляется три этапа: подготовительный, бескислородный и кислородный, в процессе которых органические вещества распадаются до неор­ганических соединений. У анаэробов, обитающих в среде, лишенной кислорода, или у аэробов при его недостатке диссимиляция протекает лишь в два первых этапа с образованием промежуточных органических соединений, еще богатых энергией.

Первый этап - подготовительный - заключается в ферментативном расщеплении сложных органических соединений на более простые (белков - на аминокислоты, жиров - на глицерин и жирные кислоты, полисахаридов - на моносахариды, нуклеиновых кислот - на нуклеотиды). Распад органических субстратов пищи осуществляется на разных уровнях желудочно-кишечного тракта многоклеточных организмов. Внутриклеточное расщепление органических веществ происходит под действием гидролитических ферментов лизосом. Высвобождающаяся при этом энергия рас­сеивается в виде теплоты, а образующиеся малые органические молекулы могут подвергнуться дальнейшему расщеплению или использоваться клеткой как «строительный материал» для синтеза собственных органических соединений.

Второй этап - неполное окисление (бескислородный) - осуществляется непосредственно в цитоплазме клетки, в присутствии кислорода не нуждается и заключается в дальнейшем расщеплении органических субстратов. Главным источником энергии в клетке является глюкоза. Бескислородное, неполное расщепление глюкозы называют гликолизом.

Гликолиз - многоступенчатый ферментативный процесс прев­ращения шестиуглеродной глюкозы в две трехуглеродные молекулы пировиноградной кислоты (пирувата, ПВК) С3Н4О3. В ходе реакций гликолиза выделяется большое количество энергии - 200 кДж/моль. Часть этой энергии (60%) рассеивается в виде теплоты, остальное (40%) используется на синтез АТФ.

В результате гликолиза одной молекулы глюкозы образуется по две молекулы ПВК, АТФ и воды, а также атомы водорода, которые запасаются клеткой в форме НАД Н, т.е. в составе специфического переносчика - никотинамидадениндинуклеотида. Дальнейшая судьба продуктов гликолиза - пирувата и водорода в форме НАД Н - может складываться по-разному. У дрожжей или в клетках растений при недостатке кислорода происходит спиртовое брожение - ПВК восстанавливается до этилового спирта:

В клетках животных, испытывающих временный недостаток кислорода, например в мышечных клетках человека при чрезмер­ной физической нагрузке, а также у некоторых бактерий происходит молочнокислое брожение, при котором пируват восстанавливается до молочной кислоты. При наличии в среде кислорода продукты гликолиза претерпевают дальнейшее расщепление до конечных продуктов.

Третий этап - полное окисление (дыхание) - протекает при обязательном участии кислорода. Аэробное дыхание представляет собой цепь реакций, контролируемых ферментами внутренней мембраны и матрикса митохондрии. Попав в мито­хондрию, ПВК взаимодействует с ферментами матрикса и образует: диоксид углерода, который выводится из клетки; атомы водорода, которые в составе переносчиков направляются к внутренней мембране; ацетилкофермент А (ацетил-КоА), который вовлекается в цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса). Цикл Кребса - это цепь последовательных реакций, в ходе которых из одной молекулы ацетил-КоА образуются две молекулы СО2, молекула АТФ и четыре пары атомов водорода, передаваемые на молекулы-переносчики - НАД и ФАД (флавинадениндинуклеотид). Суммарную реакцию гликолиза и цикла Кребса можно представить в следующем виде:

Итак, в результате бескислородного этапа диссимиляции и цикла Кребса молекула глюкозы расщепляется до неорганического диоксида углерода (СО2), а высвободившаяся при этом энергия частично расходуется на синтез АТФ, но в основном сберегается в нагруженных электронами переносчиках НАД Н2 и ФАД Н2. Белки-переносчики транспортируют атомы водорода к внутренней мембране митохондрий, где передают их по цепи встроенных в мембрану белков. Транспорт частиц по цепи переноса осуществ­ляется таким образом, что протоны остаются на внешней стороне мембраны и накапливаются в межмембранном пространстве, превращая его в Н+-резервуар, а электроны передаются на внутреннюю поверхность внутренней митохондриальной мембра­ны, где соединяются в конечном итоге с кислородом.

В результате деятельности ферментов цепи переноса электро­нов внутренняя мембрана митохондрий изнутри заряжается отрицательно, а снаружи - положительно (за счет Н), так что между ее поверхностями создается разность потенциалов. Известно, что во внутреннюю мембрану митохондрий встроены молекулы фермента АТФ-синтетазы, обладающие ионным каналом. Когда разность потенциалов на мембране достигает критического уровня (200 мВ), положительно заряженные частицы Н+ силой электрического поля начинают про­талкиваться через канал АТФазы и, оказавшись на внутренней поверхности мембраны, взаимодействуют с кислородом, образуя воду.

Нормальное протекание метаболических реакций на молекулярном уровне обусловлено гармоничным сочетанием процессов катаболизма и анаболизма. При нарушении катаболических процессов прежде всего возникают энергетические трудности, нарушаются регенерация АТФ, а также поступление необходимых для биосинтетических процессов исходных субстратов анаболизма. В свою очередь, первичное или связанное с изменениями процессов катаболизма повреждение анаболических процессов ведет к нарушению воспроизведения функционально важных соединений - ферментов, гормонов и др.

Нарушение различных звеньев метаболических цепей неравнозначно по своим последствиям. Наиболее существенные, глубокие патологические изменения катаболизма происходят при повреждении системы биологического окисления при блокаде ферментов тканевого дыхания, гипоксии и др. или повреждении механизмов сопряжения тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования (например, разобщение тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования при тиреотоксикозе). В этих случаях клетки лишаются основного источника энергии, почти все окислительные реакции катаболизма блокируются или теряют способность аккумулировать освобождающуюся энергию в молекулах АТФ. При ингибировании реакций цикла трикарбоновых кислот выработка энергии в процессе катаболизма сокращается примерно на две трети.



Механизм синтеза АТФ при гликолизе относительно прост и может быть без большого труда воспроизведён в пробирке. Однако никогда не удавалось лабораторно смоделировать дыхательный синтез АТФ. В 19б1 г. английский биохимик Питер Митчел высказал предположение, что ферменты - соседи по дыхательной цепи - соблюдают не только строгую очерёдность вступления в реакцию, но и чёткий порядок в пространстве клетки. Дыхательная цепь, не меняя своего порядка, закрепляется во внутренней оболочке (мембране) митохондрии и несколько раз "прошивает" её будто стежками. Попытки воспроизвести дыхательный синтез АТФ потерпели неудачу, потому что роль мембраны исследователями недооценивалась. А ведь в реакции участвуют ещё ферменты, сосредоточенные в грибовидных наростах на внутренней стороне мембраны. Если эти наросты удалить, то АТФ синтезироваться не будет.

Окислительное фосфорилирование, синтез АТФ из аденозиндифосфата и неорганического фосфата, осуществляющийся в живых клетках, благодаря энергии, выделяющейся при окислении орг. веществ в процессе клеточного дыхания. В общем виде окислительное фосфорилирование и его место в обмене веществ можно представить схемой:

АН2 - органические вещества, окисляемые в дыхательные цепи (так называемые субстраты окисления, или дыхания), АДФ-аденозиндифосфат, Р-неорганический фосфат.

Поскольку АТФ необходим для осуществления многих процессов, требующих затраты энергии (биосинтез, совершение механической работы, транспорт веществ и др.), окислительное фосфорилирование играет важнейшую роль в жизнедеятельности аэробных организмов. Образование АТФ в клетке происходит также благодаря др. процессам, например в ходе гликолиза и различных типов брожения. протекающих без участия кислорода. Их вклад в синтез АТФ в условиях аэробного дыхания составляет незначительную часть от вклада окислительного фосфорилирования (около 5%).

У животных, растений и грибов окислительное фосфорилирование протекает в специализированных субклеточных структурах-митохондриях (рис. 1); у бактерий ферментные системы, осуществляющие этот процесс, находятся в клеточной мембране.

Митохондрии окружены белково-фосфолипидной мембраной. Внутри митохондрий (в так называемом матриксе) идет ряд метаболических процессов распада пищевых веществ, поставляющих субстраты окисления АН2 для окислительное фосфорилирование Наиб. важные из этих процессов -трикарбоновых кислот цикл и т. наз. -окисление жирных кислот (окислит. расщепление жирной кислоты с образованием ацетил-кофермента А и кислоты, содержащей на 2 атома С меньше, чем исходная; вновь образующаяся жирная кислота также может подвергаться -окислению). Интермедиаты этих процессов подвергаются дегидрированию (окислению) при участии ферментов дегидрогеназ; затем электроны передаются в дыхательную цепь митохондрий-ансамбль окислительно-восстановительных ферментов, встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану. Дыхательная цепь осуществляет многоступенчатый экзэргонический перенос электронов (сопровождается уменьшением свободной энергии) от субстратов к кислороду, а высвобождающаяся энергия используется расположенным в той же мембране ферментом АТФ-синтетазой, для фосфорилирования АДФ до АТФ. В интактной (неповрежденной) митохондриальной мембране перенос электронов в дыхательной цепи и фосфорилирование тесно сопряжены между собой. Так, например, выключение фосфорилирования по исчерпании АДФ либо неорганического фосфата сопровождается торможением дыхания (эффект дыхательного контроля). Большое число повреждающих митохондриальную мембрану воздействий нарушает сопряжение между окислением и фосфорилированием, разрешая идти переносу электронов и в отсутствие синтеза АТФ (эффект разобщения).

Механизм окислительного фосфорилирования можно представить схемой: Перенос электронов (дыхание) А ~ В АТФ А ~ В-высокоэнергетический интермедиат. Предполагалось, что А ~ В - химическое соединение с макроэргической связью, например фосфорилированный фермент дыхательной цепи (химическая гипотеза сопряжения), или напряженная конформация какого-либа белка, участвующего в окислительное фосфорилирование (конформационная гипотеза сопряжения). Однако эти гипотезы не получили экспериментального подтверждения. Наибольшим признанием пользуется хемиосмотическая концепция сопряжения, предложенная в 1961 П. Митчеллом (за развитие этой концепции в 1979 ему присуждена Нобелевская премия). Согласно этой теории, свободная энергия транспорта электронов в дыхательной цепи затрачивается на перенос из митохондрий через митохондриальную мембрану на ее наружную сторону ионов Н+ (рис. 2, процесс 1). В результате на мембране возникает разность электрич. потенциалов и разность хим. активностей ионов Н+ (внутри митохондрий рН выше, чем снаружи). В сумме эти компоненты дают трансмембранную разность электрохимических потенциалов ионов водорода между матриксом митохондрий и внешней водной фазой, разделенными мембраной:

где R-универсальная газовая постоянная, T-абсолютная температура, F- число Фарадея. Величина обычно составляет около 0,25 В, причем основная часть (0,15-0,20 В) представлена электрической составляющей. Энергия, выделяющаяся при движении протонов внутрь митохондрий по электрическому полю в сторону меньшей их концентрации (рис. 2, процесс 2), используется АТФ-синтетазой для синтеза АТФ. Т. обр., схему окислительное фосфорилирование, согласно этой концепции, можно представить в следующем виде:

Перенос электронов (дыхание) АТФ

Сопряжение окисления и фосфорилирования через позволяет объяснить, почему окислительное фосфорилирование, в отличие от гликолитического ("субстратного") фосфорилирования, протекающего в растворе, возможно лишь в замкнутых мембранных структурах, а также почему все воздействия, снижающие электрическое сопротивление и увеличивающие протонную проводимость мембраны, подавляют ("разобщают") окислительное фосфорилирование Энергия, помимо синтеза АТФ, может непосредственно использоваться клеткой для др. целей - транспорта метаболитов, движения (у бактерий), восстановления никотинамидных коферментов и др.

В дыхательной цепи имеется несколько участков, которые характеризуются значительным перепадом окислительно-восстановительного потенциала и сопряжены с запасанием энергии (генерацией). Таких участков, называемых пунктами или точками сопряжения, обычно три: НАДН: убихинон-редуктазное звено (0,35-0,4 В), убихинол: цитохром-c-редуктазное звено (~ ~ 0,25 В) и цитохром-с-оксидазный комплекс (~ 0,6 В)-пункты сопряжения 1, 2 и 3 соотв. (рис. 3). Каждый из пунктов сопряжения дыхательной цепи может быть выделен из мембраны в виде индивидуального ферментного комплекса, обладающего окислительно-восстановительной активностью. Такой комплекс, встроенный в фосфолипидную мембрану, способен функционировать как протонный насос.

Обычно для характеристики эффективности окислительное фосфорилирование используют величины Н+/2е или q/2e, указывающие сколько протонов (либо электрических зарядов) переносится через мембрану при транспорте пары электронов через данный участок дыхательной цепи, а также отношение Н+/АТФ, показывающее, сколько протонов нужно перенести снаружи внутрь митохондрий через АТФ-синтетазу для синтеза 1 молекулы АТФ. Величина q/2e составляет для пунктов сопряжения 1, 2 и 3 соотв. 3-4, 2 и 4. Величина Н+/АТФ при синтезе АТФ внутри митохондрий равна 2; однако еще один Н+ может тратиться на вынос синтезированного АТФ4- из матрикса в цитоплазму переносчиком адениновых нуклеотидов в обмен на АДФ -3. Поэтому кажущаяся величина Н+ / АТФнаружн равна 3.

В организме окислительное фосфорилирование подавляется многими токсичными веществами, которые по месту их действия можно разделить на три группы: 1) ингибиторы дыхательной цепи, или так называемые дыхательные яды. 2) Ингибиторы АТФ-синтетазы. Наиболее распространенные ингибиторы этого класса, употребляемые в лабораторных исследованиях, - антибиотик олигомицин и модификатор карбоксильных групп белка дициклогексилкарбодиимид. 3) Так называемые разобщители окислительного фосфорилирования Они не подавляют ни перенос электронов, ни собственно фосфорилирование АДФ, но обладают способностью уменьшать величину на мембране, благодаря чему нарушается энергетическое сопряжение между дыханием и синтезом АТФ. Разобщающее действие проявляет большое число соединений самой разнообразной химической структуры. Классические разобщители - вещества, обладающие слабыми кислотными свойствами, способные проникать через мембрану как в ионизованной (депротонированной), так и в нейтральной (протонированной) формах. К таким веществам относят, например, 1-(2-дицианометилен)гидразино-4-трифтор-метоксибензол, или карбонилцианид-n-трифторметокси-фенилгидразон, и 2,4-динитрофенол (соответственно формулы I и II; показаны протонированная и депротонированная формы).

Двигаясь через мембрану в электрическом поле в ионизованной форме, разобщитель уменьшает; возвращаясь обратно в протонированном состоянии, разобщитель понижает (рис. 4). Т. обр., такой "челночный" тип действия разобщителя приводит к уменьшению

Разобщающим действием обладают также ионофоры (например, грамицидин), повышающие электропроводность мембраны в результате образования ионных каналов или вещества, разрушающие мембрану (например, детергенты).

Окислительное фосфорилирование открыто В. А. Энгельгардтом в 1930 при работе с эритроцитами птиц. В 1939 В. А. Белицер и Е. Т. Цыбакова показали, что окислительное фосфорилирование сопряжено с переносом электронов в процессе дыхания; к такому же заключению несколько позднее пришел Г. М. Калькар.

Механизм синтеза АТФ. Сопряжение диффузии протонов назад через внутреннюю мембрану митохондрии с синтезом АТФ осуществляется с помощью АТФазного комплекса, получившего название фактора сопряжения F,. На электронно- микроскопических снимках эти факторы выглядят глобулярными образованиями грибовидной формы на внутренней мембране митохондрий, причем их «головки» выступают в матрикс. F1 - водорастворимый белок, состоящий из 9 субъединиц пяти различных типов. Белок представляет собой АТФазу и связан с мембраной через другой белковый комплекс F0, который перешнуровывает мембрану. F0 не проявляет каталитической активности, а служит каналом для транспорта ионов Н+ через мембрану к Fx.

Механизм синтеза АТФ в комплексе Fi~ F0 до конца не выяснен. На этот счет имеется ряд гипотез.

Одна из гипотез, объясняющих образование АТФ посредством так называемого прямого механизма, была предложена Митчеллом.

По этой схеме на первом этапе фосфорилирования фосфатный ион и АДФ связываются с г компонентом ферментного комплекса (А). Протоны перемещаются через канал в F0-компоненте и соединяются в фосфате с одним из атомов кислорода, который удаляется в виде молекулы воды (Б). Атом кислорода АДФ соединяется с атомом фосфора, образуя АТФ, после чего молекула АТФ отделяется от фермента (В).

Для косвенного механизма возможны различные варианты. АДФ и неорганический фосфат присоединяются к активному центру фермента без притока, свободной энергии. Ионы Н + , перемещаясь по протонному каналу по градиенту своего электрохимического потенциала, связываются в определенных участках Fb вызывая конформационныё. изменения фермента (П. Бойер), в результате чего из АДФ, и Рi синтезируется АТФ. Выход протонов в матрикс сопровождается возвратом АТФ-синтетазного комплекса в исходное конформационное состояние и освобождением АТФ.

В энергизованном виде F1 функционирует как АТФ-синтетаза. При отсутствии сопряжения между электрохимическим потенциалом ионов Н+ и синтезом АТФ энергия, освобождающаяся в результате обратного транспорта ионов Н+ в матриксе, может превращаться в теплоту. Иногда это приносит пользу, так как повышение температуры в клетках активирует работу ферментов.